Simone
成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
1，凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析
2，吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析
3，处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上
4，处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测
成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！
一般需要设置的对照如下：
阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
内参对照：检测标本的质量和二抗系统
空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
WB检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1）根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
蛋白位置
推荐buffer
全细胞
NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2）选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态
凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
Reduced - Denatured
还原，变性
含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
含SDS
Reduced - Native
还原，不变性
含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
不含SDS
Oxidized - Denatured
不还原，变性
不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS
含SDS
Oxidized - Native
不还原，不变性
不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS
不含SDS
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
蛋白分子量（kDa）
凝胶浓度（％）
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8
4、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、NC膜和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
PVDF膜
NC膜
尼龙膜
灵敏度和分辨率
高
高
高
背景
低
低
较高
蛋白结合能力
100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）
80-100ug/cm2
>400ug/cm2
机械强度
强
干的膜易脆
软而结实
溶剂抗性
强
差
差
使用前是否需要浸润
100%甲醛润湿
缓冲液润湿
缓冲液润湿
适用染色方法
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
不能用阴离子染料
适用检测方法
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
显色法、化学发光、荧光、放射性
显色、化学发光、放射性
适用范围
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格
高
较低
低
