Simone
透射电镜试样制备
一、实验内容及目的
了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射 电镜试样。
二、薄膜样品的制备
用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm 之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：
第一步 从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm 厚的薄片。电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。电火花切割可切下厚度小于0.5mm 的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步 样品薄片的预减薄。预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。（如果材料较硬，可减薄至70μm 左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm 。另一种预先减薄的方法是化学薄化法。这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中 ，使它表面受腐蚀而急需减薄。因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步 最终减薄 目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图 为一台双喷式电解抛光装置的示意图。将预先减薄的样品剪成直径为3mm 的圆片, 装入样品夹持器中。进行减薄时，针对样品两个表面的中心部位各有一个电解液喷嘴。从喷嘴中喷出的液柱和阴极相接 ，样品和阳极相接。电解液是通过一个耐酸泵来进行循环的。在两个喷嘴的轴线上还装有一对光导纤维，其中一个光导纤维和光源相接，另一个和光敏元件相接。如果样品经抛光后中心出现小孔，光敏元件输出的电信号就可以将抛光线路的电源切断。用这样的方法制成的薄膜样品，中心孔附近有一个相当大的薄区，可以被电子束穿透，直径3mm 圆片上的周边好似一个厚度较大的刚性支架，因为透射电镜样品座的直径也是3mm ，因此，制备好的样品可直接装入电镜进行观察分析。
对于不导电的陶瓷材料和脆性材料，最终减薄可采用离子减薄法。该法是用离子束在样品的两侧以一定的倾角（5-30）轰击样品，使之减薄。由于陶瓷样品硬度高，耐腐蚀，因此，离子减薄的时间长。对于要求较高的金属薄膜样品，在双喷后再进行一次离子减薄，效果会更好。
参考资料
中华文本库：
透射电镜生物样品制备步骤
生物样品, 透射电镜, 制备步骤
一．取材：
组织块小于1立方毫米
二．固定：
2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。
用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次
1%锇酸固定液固定 2-3小时
用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次
三．脱水：
50%乙醇 15-20分
70%乙醇 15-20分
90%乙醇 15-20分
90%乙醇 90%丙酮（1：1） 15-20分
90%丙酮 15-20分
以上在4度冰箱内进行
100%丙酮 室温 15-20分三次
四．包埋：
纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时
纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜
纯包埋液 37度 2-3小时
五．固化：
37度烘箱内 过夜
45度烘箱内 12小时
60度烘箱内 24小时
六．超薄切片机切片 50-60 nm
七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
八．透射电镜观察。拍片
由于生物样品含水太多，在电镜中会被真空蒸发掉从而破坏了结构，所以需要一些能够把水温和取代掉、并且自身没有结构的物质，这就是树脂包埋剂。正因为生物脆弱、结构容易破坏，所以才需要温和的制样方法，方法才这么复杂。生物电镜制样就是最主要的工作，看电镜倒是次要的。以下是生物样品超薄切片的流程图：
一、粉末样品的制备
1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。）
2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上；
3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上（如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。滴得太多，则粉末分散不开，不利于观察，同时粉末掉入电镜的几率大增，严重影响电镜的使用寿命；滴得太少，则对电镜观察不利，难以找到实验所要求粉末颗粒。建议由老师制备或在老师指导下制备。）
4．等15 min以上，以便乙醇尽量挥发完毕；否则将样品装上样品台插入电镜，将影响电镜的真空。
二、块状样品制备
1．电解减薄方法
用于金属和合金试样的制备。（1）块状样切成约0.3mm厚的均匀薄片；（2）用金刚砂纸机械研磨到约120~150μm厚；（3）抛光研磨到约100μm厚；（4）冲成Ф3mm 的圆片；（5）选择合适的电解液和双喷电解仪的工作条件，将Ф3mm 的圆片中心减薄出小孔；（6）迅速取出减薄试样放入无水乙醇中漂洗干净。
注意事项：
（1）电解减薄所用的电解液有很强的腐蚀性，需要注意人员安全，及对设备的清洗；
（2）电解减薄完的试样需要轻取、轻拿、轻放和轻装，否则容易破碎，导致前功尽弃；
